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Antiguo 01/08/09, 13:36:20   #1
Troncotron
 
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Cultivo in vitro

Hola, ahi van mis últimas experiencias con el cultivo in vitro casero. Con este tema me gustaría aclarar que éstas técnicas no tienen porqué quedar relegadas únicamente a los laboratorios, y animar a todos los que nos encantan la ciencia y las plantas a ponerse con ello. Ahí va..

Material:

-Pinzas
-Bisturí
-Mechero
-Agua destilada
-Lejía
-Botes de cristal o contenedores de polipropileno (PP5)
-pHmetro
-KOH (u otro producto para subir el pH)
-Báscula
-Agar
-Medio de cultivo (MS)
-Reguladores de crecimiento (auxinas y citoquininas)
-Azúcar
-Olla a presión
-Pipeta o jeringa para medir pequeños volúmenes.
-Jarra (para medir volúmenes)

Y lo más importante, una cámara que nos permita trabajar en un ambiente estéril. Hay varias opciones en éste punto:

-Glovebox: Es la opción más barata, por unos 20-40 euros podemos fabricarla, y por un poco más le podemos poner una bombilla UVC para esterilizar superficies


- Flowhood: La construí siguiendo un manual en internet. Sale un poco más cara, ya que cuenta con un filtro HEPA y un extractor adecuado para conseguir un flujo laminar, pero te ofrece una comodidad digna de una cabina de laboratorio.


Tutorial de construcción: http://www.fungifun.org/English/Flowhood#construction

Medio de cultivo

El medio de cultivo utilizado es el Murashige & Skoog, y para el buen desarrollo de los explantos el pH fue corregido a 5,8 con KOH (durante la esterilización desciende unos 0,3 puntos) se le añadieron 15 g/L de dextrosa y 10 g/l de agar. Además, se le añadió la siguiente concentración hormonal:

-Kinetina (2 mg/l) ------- (Citoquinina)
-AIA (0,2 mg/l) ---------- (Auxina)

La concentración hormonal ideal varía mucho entre especies. Para empezar utilicé una regla habitual para el cultivo de yemas que suele ser usar 10 veces más citoquininas que auxinas. Como el material vegetal era relativamente viejo usé una concentración que me pareció bastante alta de citoquininas (2mg/L).

Esta concentración hormonal favorecerá la proliferación celular y el consiguiente crecimiento de los tejidos. Cuando las yemas hayan crecido lo suficiente, las cambiaré a otro medio con diferente concentración para que enraicen.

Si quisieramos establecer un protocolo para optimizar la micropropagación, habría que probar distintos genotipos y distintas concentraciones hormonales para el mismo medio, y después quedarnos con la mejor.

Material vegetal

- Ramas de potos (Epipremnum aureum)
- Ramas de cáñamo (Cannabis sativa)

Esterilización del medio

El medio de cultivo fue esterilizado en la olla a presión durante 40 minutos desde que se alcanza la máxima presión.

Esterilización del material vegetal

Para esterilizar el material vegetal, seguí las siguientes indicaciones:

-1 minuto sumergidas en alcohol 70%
-10 minutos sumergidas en agua destilada + lejía al 15%
-3 lavados consecutivos de 5 minutos en agua destilada estéril.

Éste es el apartado más delicado, ya que si te pasas con la lejía o el tiempo, los explantos se mueren, y si no llegas no acabas con todos los hongos/bacterias y tus cultivos se contaminan.

Siembra

La siembra de los explantos se realizó en condiciones de esterilidad gracias a al flujo laminar. Sembré explantos con y sin meristemos para observar las distintas respuestas.

Mantenimiento

Fotoperíodo 16/8 con un fluorescente de bajo consumo de 20W.

Última edición por Troncotron fecha: 09/08/09 a las 21:27:15.
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Antiguo 01/08/09, 13:39:27   #2
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Re: Cultivo in vitro

Ahi van los resultados:

Vista general:



Potos:

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Antiguo 01/08/09, 13:41:50   #3
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Re: Cultivo in vitro

Cañamo:

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Antiguo 01/08/09, 17:00:17   #4
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Re: Cultivo in vitro

Muy interesante Troncoton y sobre todo me parece excelente el link para poder construir la campana de flujo laminar. Una pregunta veo que utilizas vasos de plástico, ¿son de plástico comun y corriente y cómo los esterilizas?
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Antiguo 01/08/09, 18:14:07   #5
Troncotron
 
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Re: Cultivo in vitro

Hola Acourtia! Los vasos tienen que ser de polipropileno. Para asegurarnos, en la base debe aparecer el siguiente símbolo:



PP significa Polipropileno, y el número creo que corresponde al espesor. Cualquier otra indicación que no sea PP5 (PET, LDPET, etc..) no resistirá la temperatura de esterilización (en la olla express 30-40 minutos).

Respecto a la cabina de flujo laminar funciona genial, y si le colocas un avance de metacrilato y una lámpara UVC ya es la bomba Por unos 200-300 euros te cumple la misma función que una de 5000, y hay incluso quien le pone contador de horasy todo..
Un saludo
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Antiguo 01/08/09, 18:52:06   #6
Mileth
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Mileth va por buen camino
Re: Cultivo in vitro

hola , he leido mucho este tema ya que tambien soy aficionada a las orquideas , de antemano te felicito y que bueno que nos compartas tu experiencia.... a ver si algun dia dejo de leer tanto para dar manos a la obra.... me surgen algunas aun para iniciar esta aventura in vitro...Muchisima suerteeeeeee
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Antiguo 05/08/09, 11:37:30   #7
Troncotron
 
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Re: Cultivo in vitro

Hola Mileth, te animo a que te pongas con ello, la satisfacción de ver como crecen y evolucionan los explantos sin contaminarse es única. Pronto empezaré nuevos experimentos con semillas de cactus y orquídeas. Cualquier cosa que quieras preguntar no te cortes, intentaré ayudar en lo que pueda
Un saludo
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Antiguo 07/08/09, 03:47:32   #8
pelargonium
 
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Re: Cultivo in vitro

Buenísimo este post!!
Y felicitaciones por el trabajo y los resultados!!!!

Y ya que dices que preguntemos...aqui van varias preguntas :

Los tallos de potos, uno (el brotado) se ve en la foto que tiene un nudo....los otros no?

Los recipientes de PP que usas son de esos rígidos de pared más gruesa o son los de pared fina (que son más blandos)?

Cuanto tiempo tardaron en brotar así como se ve en las fotos?

Espero que sigas poniendo fotos para ver como van evolucionando!
Está excelente!!
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Antiguo 07/08/09, 14:00:57   #9
Troncotron
 
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Re: Cultivo in vitro

Hola pelargonium! gracias por pasarte

En el cultivo in vitro hay multitud de técnicas, todas ellas parecidas en el fondo pero muy diferentes en los detalles. Me explico, lo que hace que un determinado tejido de una especie muestre una respuesta concreta (medio de cultivo con concentración hormonal X), no lo hace igual ni para otro tejido de la misma especie, ni mucho menos para otro tejido de una especie distinta.

Las fotos muestran la utilidad más intuitiva, la micropropagación por cultivo de yemas de un solo nudo ("single node culture"), que básicamente son esquejes muy pequeños (sin hojas), que contienen una yema de crecimiento. Éste caso es el más sencillo ya que no tienes que inducir la aparición de brotes adventicios. En el caso del poto a los 8-10 día ya había respuesta.

También sembré algunos explantos sin "nudo" (unos 8),pero tan solo uno ha respondido:



Éste método es lo que se denomina "organogénesis directa", y requiere una concentración hormonal diferente al anterior método, y variable según la edad de la planta, el tipo de hormona e incluso la variedad. Aqui la cosa cambia, ya que tienes que inducir brotes adventicios. De éste primer experimento podríamos concluir que el medio que he usado con la concentración hormonal que puse arriba, funciona para la propagación de yemas pero no va tan bien para la organogénesis directa.

Respecto a lo de los envases de plástico, valen todos en los que aparezca el símbolo de PP5.

Pronto subiré alguna foto más actualizada.

Un saludo!
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Antiguo 08/08/09, 22:42:56   #10
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Re: Cultivo in vitro

Ahi van algunas fotos actualizadas. Ya hay dos explantos sin nudo en los que están empezando a aparecer nuevos tallos:


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Antiguo 09/08/09, 20:48:25   #11
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Re: Cultivo in vitro

Sensacional!!!!

Me hiciste dar ganas de probar... voy a ver si me animo...
(Se me va a contaminar todo seguro, pero bueno...quien no arriesga...jejeje)

Buenísimo como te salió y es increible lo rápido que ocurrió la organogénesis. (cuanto fue? 20 dias? algo así?)

En el potos (Epipremnum aureum) también se pueden usar pecíolos o fragmentos de hoja, pero dicen que demoran mucho más.

Buenísimo el post!!!!!
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Antiguo 09/08/09, 21:37:40   #12
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Re: Cultivo in vitro

Gracial pelargonium!
Te recomiendo que pruebes con cotiledones e hipocotilos de tomate, de lo que he probado es lo más fácil de propagar, en 2-3 semanas estaban así:



Además en tomate no es absolutamente necesario el uso de hormonas, ya que en medios 0/0 se pueden regenerar tallos. Lo complicado será conseguir las sales, aunque puedes hacer tus pruebas con diferentes concentraciones de abono líquido + vitaminas + azúcares. Si quieres intentarlo más en serio te puedo decir donde lo venden por internet. Por cierto, gracias a tu post me he dado cuenta de que estaba equivocado en el nombre científico del poto, ya lo he editado

Un saludo
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Antiguo 10/08/09, 19:44:39   #13
Mileth
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Mileth va por buen camino
Re: Cultivo in vitro

Trocoton Felicidades y muchisimas gracias, estos foros son fenomenos y muy colaboradores todos
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Antiguo 12/08/09, 17:49:44   #14
pelargonium
 
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Re: Cultivo in vitro

Hola!

hace un tiempo me consiguieron algo de medio MS y alguna hormona (BAP), y aquí ANA se consigue en cualquier lugar con o sin vitamina B, que se vende como hormona para enraizar.

Buenísimos los tomates!

Vos te vas a reir pero lo que me pasa es que a veces no me motiva probar con cosas que salen directo y facil de semilla, o con plantas tipo violeta africana como hacen todos, pero que uno pone una hoja en agua sola y salen un monton de plantitas sin agregar nada.

Obvio, ya se que hay que hacerlo para practicar, pero eso me saca las ganas!

Igual, ahora que mostraste tomates, ya le eche el ojo a unas semillas de tomates enanos!!! , que son las plantas de tomate mas chicas que existen (que se pueden tener hasta en el alfeizar de una ventana o sino en una pequeña maceta colgante), que son plantas chiquitas pero dan buenos tomates y de esas venden de a muy pocas semillas.... ahi sí valdría la pena!!

Vamos a ver que hago, ya me puse a hacer algunas pruebas! jejeje

Abrazos y que siga este post!!!
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Antiguo 22/08/09, 21:02:28   #15
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Re: Cultivo in vitro

Uff se fue para abajo este post!
Es una pena que se pierda!

A poner más fotos Troncotron!

Aca va una pruebita que hice:

Elegí "como víctima" una nativa de aquí y de otros países de Sudamérica: Glandularia peruviana


Aqui el esquejito despues de dos semanas en frasco:


Se ve que formó callus bastante rápido abajo:


Y a partir del callus van formándose nuevas plantitas (abajo):



A mostrar tus progresos Troncotrón que tienes muchas más ya hechas!!!!
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